層析技術

　　一、概念

　　利用混和物中各組分理化性質（吸附力、分子形狀、大小、分子極性、分子親和力以及分配系數(shù)）的差異，在物質經(jīng)過兩相中進行分離的一種技術。

　　本世紀初（1903年），植物學家M.C.Jber發(fā)現(xiàn)并使用這一技術證明了植物的葉子中不僅有葉綠素，還含有其他色素，實際上他使用的吸附層析。現(xiàn)在層系法已成為生化、分子生物學及其它學科領域有效的分離、分析工具之一。

　　二、原理

　　具體過程：可分離物質：糖類、有機酸、氨基酸、核苷酸。

　　三、分類

　　1.  按兩相所處物理狀態(tài)分類

　　氣相層析：氣液層析（固定相為液體）和氣固層析（固定相為固體），流動相為氣體。

　　液相層析：液液層析（固定相為液體）和液固層析（固定相為固體），流動相為液體。

　　2.  按層析方式分類

　　柱層析：固定相裝于柱內，使樣品沿著一個方向移動而分離。

　　薄層層析：將適當粘度的固定相均勻鋪在薄板上，點樣后，用流動相展開。

　　紙層析：用濾紙作液體的載體，點樣后用流動相展開。

　　3.  根據(jù)層析原理分類：常用分類法

　　（1）吸附層析：固定相是固體吸附劑，通過對不同溶質吸附力強弱不同進行分離。

　?。?）分配層析：利用兩相中的分配系數(shù)不同。

　　分配系數(shù)：當一種溶質在兩種給定的互不相溶的溶劑中分配時，在一定溫度下達到平衡后，溶質在兩相中的濃度比值為一常數(shù)，即分配系數(shù)（Kd）

　　Kd＝Ca / Cb

　　Ca和Cb分別代表某一物質在互不相溶的兩相，A相（動相）和B相（靜相）中的濃度。

　　（3）離子交換層析：固定相是離子交換劑，各組分與其親和力不同

　?。?）凝膠層析：固定相是多孔凝膠，根據(jù)流動相中溶質的分子量大小差異進行分離

　?。?）親和層析：利用固定相載體表面偶聯(lián)具有特殊親和作用的配基，與溶質分子發(fā)生可逆的特異性結合進行分離

　?。?）金屬螯合層析

　　（7）疏水層析

　?。?）反相層析

　　四、凝膠層析（又叫凝膠過濾或分子篩）

　　凝膠層析是指混和物隨流動相流經(jīng)固定相的層析柱時，混合物中各組分按其分子大小不同而被分類的技術。

　　1.  原理

　　凝膠層析的固定相是凝膠。凝膠是一種不帶電荷的具有三維空間多孔網(wǎng)狀結構的物質，凝膠的每個顆粒內部都具有很多細微的小孔，如同篩子一樣。

　　常用凝膠有瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、葡聚糖凝膠等。

　　葡聚糖凝膠介質是由多聚葡聚糖與環(huán)氧綠丙烷交連而成。最常用的葡聚糖凝膠層析介質是Sephadex G系列，不同型號的凝膠用G表示，G代表交聯(lián)度，從G10到G100?！癎”后面的        數(shù)字表示每10g干膠的吸水量，可根據(jù)待分離混和物分子量大小選用不同“G”值的凝膠。

　　2.  分離過程：

　　樣品隨洗脫液的流動下移

　　3.  影響凝膠柱層析的主要因素

　?。?）層析柱的選擇與裝填

　　層析柱的大小應根據(jù)分離樣品量的多少及對分辨率的要求而定。凝膠柱填裝后用肉眼觀察應均勻、無紋路、無汽泡。

　　（2）流動相――洗脫液的選擇：是含有一定濃度鹽的緩沖液，目的是為了防止凝膠可能有吸附作用。其選擇主要取決于待分離樣品，一般來說只要能溶解洗脫物質，并不使其變性的緩沖液都可用于凝膠層析。

　　（3）加樣量：加樣量的多少應根據(jù)具體的實驗而定：一般分級分離時加樣量約為凝膠柱床體積的1％——5％，而分組分離時加樣量約為凝膠柱床體積的10%-25%.

　?。?）凝膠再生：葡聚糖凝膠再生使用NaOH（0.2M）和NaCl（0.5M）混合液處理。

　　五、離子交換層析

　　離子交換層析是利用固定相偶聯(lián)的離子交換基團和流動相解離的離子化合物之間發(fā)生可逆的離子交換反應而進行的分離方法。

　　1.  原理

　　離子交換交換層析是利用離子交換劑對各種離子的親和力不同，借以分離混和物中各種離子的一種技術。其主要特點是依靠帶有相反電荷的顆粒之間的吸引力的作用。

　　離子交換層析的固定相是載有大量電荷的離子交換劑，流動相是具有一定pH值和一定離子強度的電解質溶液。

　　離子交換劑按其所帶電荷性質，分為：

　　陰離子交換劑帶正電荷，與混合物中帶負電的組分結合 陰離子交換層析。

　　陽離子交換劑 帶負電荷，與混合物中帶正電的組分結合 陽離子交換層析。

　　常用離子交換劑有：離子交換樹脂，離子交換纖維素等