關于HPLC的流動相，十個你不知道的“坑”

　　加入有機溶劑之后測量移動相酸堿度

　　校準pH計，得到水溶液的正確pH回讀值——您要驗證的緩沖液是含水的。如果你用有機添加劑測量pH值，得到的pH值會與添加有機溶劑之前的值不同。

　　然而，最重要的一點是要保持一致。如果你總是在加入有機溶劑之后測量pH值，那么務必保證在使用的方法中陳述你的步驟，這樣的話其他人就會按照統(tǒng)一方式進行。這種方式并不保證百分百準確，但是至少可以保持方法的前后統(tǒng)一。這也許會比得到精準的pH值更加重要。

　　沒有使用緩沖液

　　緩沖劑的作用就是用來控制Ph值并阻止其發(fā)生變化。很多其他方法會改變流動相的Ph值，會引起停留時間、峰形以及峰值響應的漂移。

　　甲酸、TFA等不是緩沖劑。

　　沒有在正常酸堿度范圍內(nèi)使用緩沖液

　　每個緩沖鹽有2個pH單位范圍寬度，在這個范圍內(nèi)可以提供穩(wěn)定性最佳的pH值。窗口之外的緩沖鹽不具備有效的抗pH值變化能力。要么在正確的范圍內(nèi)使用緩沖劑，要么選擇一種緩沖劑可以涵蓋你所需要的pH值。

　　向有機溶液中加緩沖液

　　將緩沖溶液與有機相混合，會極有可能引起緩沖液沉淀。在很多情況下，即使沉淀現(xiàn)象已經(jīng)發(fā)生了，但仍很難被發(fā)現(xiàn)。記住，一定要將有機溶液加入到水相當中，這可以很好的降低緩沖液沉淀的幾率。

　　從0%用泵混合濃度梯度

　　現(xiàn)在使用的泵可以有效的混合流動相并實現(xiàn)在線脫氣，但并不是使用你的方法的任何人都會配有高質(zhì)量的泵。將A和B混合到一個單獨的溶液中，在100%線上運行。

　　比如說通過用50ml水混合制備有機950ml起始混合物。這樣做的好處就是可以減少HPLC之間的可變性，減少系統(tǒng)中產(chǎn)生氣泡和沉淀的可能性。值得注意的是泵混合液的比例是95:5并不代表瓶體的預混合保留時間也為95:5。

　　不要使用正確的改性酸或改性堿改變緩沖液

　　只能使用形成你使用的緩沖鹽的酸或堿。比如磷酸鈉緩沖液應僅用磷酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)。

　　沒有在方法中闡述有關緩沖液的全部信息，比如說在1000ml的水中加入5g磷酸鈉。

　　緩沖劑的類型決定了能夠緩沖的Ph范圍。所需的濃度決定了緩沖強度。5克或無水磷酸鈉和5克一水合物磷酸一鈉具有不同的緩沖強度。

　　還沒先檢查就開始添加有機溶液

　　如果上一個方法中基線B中使用過的是緩沖液，而你的方法中，基線B使用的是有機溶液，好在你可以沉淀泵管和泵頭中的緩沖劑。

　　支起瓶體清空最后一滴

　　很有可能你沒有足夠的流動相完成整個操作，最后樣品會冒煙的。除了可能存在燒干泵系統(tǒng)和柱子的可能性之外，流動相也會蒸發(fā)的一干二凈，瓶體頂部的流動相會發(fā)生變化。

　　利用超聲脫氣的流動相

　　最重要的一點就是確保所有的緩沖鹽已經(jīng)溶解，但是這是一種效果最差的脫氣方式，并且它會很快讓流動相升溫，從而引起有機成分蒸發(fā)掉。為了省去之后不必要的麻煩，請用五分鐘時間使用真空過濾你的流動相。